Alicia Aranaz Martín
Servicio de Micobacterias
Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET)
Universidad Complutense

Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos difíciles de eliminar que colonizan ambientes muy dispares formando parte de la microbiota habitual de la piel, la garganta y las fosas nasales de sus hospedadores vertebrados. Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo aerobio o anaerobio facultativo que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa positivo.  Posee numerosos factores de virulencia, en su mayoría componentes de la pared celular, y una variedad de exoproteínas que facilitan la colonización de nuevos hábitats.  Estas propiedades, hacen que los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que van desde afecciones superficiales de la piel a patologías severas como neumonías, meningitis, intoxicaciones alimentarias, shock séptico y desórdenes autoinmunes. De gran preocupación, es el hecho de que S. aureus sea un importante agente de infecciones nosocomiales fulminantes.

La mayoría de las cepas de estafilococos son productoras de enzimas (nucleasas, proteasas, lipasas, hialuronidasas y colagenazas) y citotoxinas (las denominadas hemolisinas α, β, δ y γ) que contribuyen a transformar los tejidos del hospedador en substrato para su crecimiento y desarrollo.  Algunas especies de estafilococos son productoras de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo peso molecular (M_r 22-31.000) conocidas como enterotoxinas estafilocócicas (SEs). S. aureus produce alrededor de 11 serotipos distintos de SEs, además de otras toxinas de gran virulencia para los mamíferos denominadas toxina del síndrome del shock tóxico-1 (TSST-1) y toxinas exfoliativas ETA y ETB.  Estas enterotoxinas son causa de intoxicaciones alimentarias por la ingesta de productos contaminados de origen cárnico y lácteo.  La patología de la intoxicación cursa inicialmente con síntomas similares a la gripe, fiebre alta, eritema dérmico, hipotensión, nauseas, vómitos frecuentes y diarrea, pudiendo llegar a desencadenar un shock tóxico orgánico el cual, en un 5% de los casos, es causa de defunción.

Las SEs y la TSST-1 reciben la denominación de superantígenos por su capacidad para activar policlonalmente a los lifocitos T de mamíferos. Los superantígenos se unen simultáneamente a las cadenas α o β de los antígenos de clase II (MHC-II) del principal complejo de histocompatibilidad de los macrófagos y a la región variable (V_β) del receptor del linfocito T CD4⁺ (TCR V_β) entrecruzándolos, lo que dispara la activación policlonal de entre un 20% y un 50% de los linfocitos T (un antígeno convencional activa el 0,001% de las células T CD4⁺).  Semejante activación desencadena la secreción masiva de citocinas proinflamatorias: interleucinas 1 y 2, factor necrosante tumoral, interferón-γ, y otras, por parte de los leucocitos entrecruzados que dan origen a las patologías asociadas con las intoxicaciones alimentarias y el síndrome del shock tóxico.               

            Controlar las infecciones por S.aureus no es tarea fácil debido a su patogénesis multifactorial y a la constante aparición de cepas resistentes a los antibióticos, en particular a meticilina y vancomicina.  Por otra parte, en la infección por S. aureus el sistema inmunitario del hospedador esta deprimido por las alteraciones que los superantígenos causan al sistema inmunitario.  En la actualidad, se sabe que algunos antígenos de esta bacteria como el polisacárido capsular y las proteínas que unen colágeno y fibrinógeno inducen potentes respuestas inmunes al ser inoculadas en un contexto antigénico diferente al bacteriano.  Con este fin, se realizan ensayos vacunales de fase III con inmunógenos conjugados de los serotipos 5 y 8 del polisacárido capsular y el toxoide de la exotoxina A de P. aeruginosa (Staph VAX).  Otra vía prometedora la constituye la sueroterapia basada en antisueros policlonales y en anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos a dianas bacterianas como el factor aglutinante (ClfA) para inhibir su adherencia a las células del hospedador.

         Dadas las actuales dificultades para controlar las infecciones por S. aureus, cobran importancia las medidas preventivas encaminadas a la detección de este patógeno en alimentos e instalaciones nosocomiales.  Algunas de las técnicas existentes resultan poco sensibles (inmunodifusión, aglutinación) y otras costosas (PCR).  En un intento de aportar métodos alternativos de detección de las enterotoxinas estafilocócicas, en el Servicio de Inmunología del Centro Nacional de Microbiología (ISCIII) de Majadahonda en colaboración con el Laboratorio de Vigilancia Sanitaria (VISAVET), hemos desarrollado inmunoensayos de captura basados en anticuerpos monoclonales de ratón que permiten detectar y cuantificar en poco tiempo nanogramos de la enterotoxina estafilocócica B (SEB) y la toxina TSST-1. Estos inmunoensayos constituyen herramientas útiles en la prevención de estas infeccionnes, siendo la inmunoterapia pasiva otra posible aplicación de los anticuerpos monoclonales obtenidos frente a estas toxinas.

Referencias:

An antidote for Staphylococcus aureus pneumonia?. The Journal of Experimental Medicine. Frank R. DeLeo and Michael Otto. 2008 Feb 18;205(2):287-94

Vanessa Fernández Gómez
Servicio de Inmunología
Centro Nacional de Microbiología
Instituto de Salud Carlos III

Los métodos rápidos y automatizados en microbiología de los alimentos requieren un tiempo reducido para la obtención de los resultados en comparación con los métodos “convencionales”, y son fáciles de usar, precisos y económicamente rentables. En la primera parte de este blog se describieron las innovaciones introducidas recientemente en los métodos empleados para el recuento de las células viables y la medición de la biomasa. En esta segunda parte, se tratan las referidas a los sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico, y a los métodos inmunológicos y genéticos.

Sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico

Los sistemas miniaturizados surgen a partir del concepto de la placa microtituladora (96 pocillos, formato 8x12), que permite reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos, así como estudiar en un formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran número de aislados o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado. Esta línea de investigación ha permitido desarrollar algunos de los medios de cultivo selectivos que se encuentran en el mercado actualmente. Entre los sistemas miniaturizados de identificación microbiana disponibles en la actualidad, basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su detección mediante diversos sistemas indicadores, destacan los siguientes: tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas (O.B.I.S., Oxoid); galerías que permiten la identificación de más de 800 especies de bacterias y levaduras (API, bioMérieux); tubos de plástico con compartimentos que contienen agar con distintos sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia (BBL Enterotube y Oxi/Ferm Tube, BD); y soportes plásticos con pocillos de fácil inoculación que contienen sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado que se rehidratan en contacto con la muestra (BBL Crystal, BD; RapID systems y MicroID, Remel; Biochemical ID systems, Microgen).

Uno de los sistemas miniaturizados y automatizados más conocidos y sofisticados es el sistema VITEK (bioMérieux) que, basándose en cambios de color de los sustratos o en la producción de gas de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta plástica que contiene los sustratos bioquímicos en forma deshidratada, puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli en 2-4 h. Una rapidez similar en la obtención de resultados puede obtenerse con el sistema Biolog (AES Chemunex) que detecta la capacidad de los microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono. Los 295 (4x1028) patrones metabólicos posibles permiten, además de la identificación, el establecimiento de relaciones filogenéticas entre distintos aislados. El empleo de un único cromógeno como indicador rédox, el violeta de tetrazolio, que se reduce de forma irreversible a formazán (color violeta) como consecuencia de la actividad metabólica bacteriana, facilita la lectura visual de los resultados. En cualquier caso, la mayoría de los sistemas citados en esta sección ofrecen la posibilidad de lectura e interpretación de resultados de manera automática.

Métodos Inmunológicos

Los métodos inmunológicos se basan en la reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo policlonal o monoclonal. En microbiología de los alimentos, el método inmunológico más empleado para la detección de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) tipo sándwich. En los últimos años, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el ensayo ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la detección de Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. y toxinas estafilocócicas (Assurance EIA y TRANSIA PLATE, Biocontrol; TECRA VIA, Biotrace International; Salmonella UNIQUE, Tecra; Detex, Molecular Circuitry Inc.). Un número considerable de laboratorios de microbiología de los alimentos emplea instrumentos automatizados basados en una variante de la tecnología ELISA conocida como ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay), en la que el producto final de la reacción es fluorescente en lugar de cromogénico, para la detección de los patógenos alimentarios mencionados (VIDAS, bioMérieux).

En ocasiones, se utiliza la técnica de separación inmunomagnética (SIM), que emplea partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos (Dynabeads, Dynal), para concentrar el antígeno de interés como etapa previa a la realización del ELISA. La SIM permite reducir el tiempo requerido para el enriquecimiento de la muestra, así como obtener suspensiones que contienen menor cantidad de partículas del alimento, lo que facilita su procesado posterior mediante distintas técnicas (hibridación con sondas génicas, PCR, etc.). Para laboratorios con un volumen moderado de muestras a analizar existen kits de diagnóstico basados en el principio de la inmunocromatografía de flujo lateral caracterizados por ser rápidos, sencillos y no requerir instrumentación especial (VIP, Biocontrol; Reveal, Neogen; RapidChek, Strategic Diagnostics). Otro tipo de ensayos inmunológicos rápidos y listos para usar son los basados en la inmunodifusión en un vial de agar para la detección rápida de serovares mótiles de Salmonella (1-2 Test, Biocontrol) o en la aglutinación reversa pasiva con partículas de látex para la detección de microorganismos patógenos (Microscreen, Microgen Bioproducts) y toxinas microbianas (RPLA kits, Oxoid).

Métodos Genéticos

A diferencia de los métodos citados en las secciones anteriores, que detectan características fenotípicas sujetas de manera natural a variación, los métodos genéticos se dirigen a la detección de características celulares mucho más estables contenidas en los ácidos nucleicos. Una técnica para detectar dichas características en ausencia de instrumentación especializada es la hibridación de ácidos nucleicos. Los ensayos comerciales actuales emplean sondas genéticas (oligonucleótidos sintéticos) marcadas enzimáticamente que, tras hibridar con regiones específicas del ARN ribosómico (una célula bacteriana puede contener hasta 10.000 copias de ARN ribosómico frente a una única copia de ADN cromosómico), catalizan una reacción que da lugar a un producto coloreado a partir de un sustrato cromogénico, lo que es indicativo de la presencia del microorganismo en el alimento (GeneQuence, Neogen). En los últimos años es cada vez más frecuente en los laboratorios de microbiología de los alimentos el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN de los microorganismos diana y disponer así de una cantidad suficiente que permita su detección. Se trata de una técnica específica, sensible (en teoría, puede detectar una única copia del ADN diana en el alimento; en la práctica se necesitan unas 103 ufc/ml para una detección reproducible) y rápida, a lo que contribuye el desarrollo de metodologías alternativas de detección de los productos de PCR que evitan el procesamiento post-reacción. Dichas metodologías están basadas en el empleo de agentes intercalantes (por ejemplo, SYBR Green) o sondas específicas con doble marcaje fluorescente que, además de posibilitar la “visualización” del progreso de la reacción, facilitan la automatización del proceso y permiten la cuantificación de la cantidad de DNA diana presente inicialmente en la muestra (PCR cuantitativo en tiempo real).

A pesar de tratarse de una técnica sofisticada, el empleo de la técnica de PCR en tiempo real en el laboratorio de microbiología de los alimentos se está viendo facilitado en los últimos años por el desarrollo de sistemas para la detección de patógenos de los alimentos que son fáciles de utilizar, requieren una manipulación mínima y reducen la necesidad de interpretación de los resultados (BAX Q7, Du Pont Qualicon; iQ-Check, Bio-Rad; TaqMan Pathogen Detection Kits, Applied Biosystems; Roche/Biotecon Diagnostics LightCycler, Roche; Warnex, AES Chemunex). La técnica de PCR cuantitativo en tiempo real es una de las opciones más prometedoras en los laboratorios de control de calidad de los alimentos, no solo para la identificación y cuantificación de microorganismos, sino también para la determinación de la presencia de organismos modificados genéticamente en materias primas y productos terminados y para la autentificación de productos en los que pueda producirse un fraude por sustitución de especies por otras de menor valor comercial.

La investigación epidemiológica de brotes alimentarios y la monitorización rutinaria de microorganismos en el ambiente requiere sistemas que sean capaces de identificar los microorganismos más allá del nivel de especie. Para ello, partiendo de una colonia de cultivo puro, pueden emplearse procedimientos automatizados basados en la hibridación de sondas específicas con fragmentos de restricción del ADN (Riboprinter, DuPont Qualicon) o técnicas más difícilmente automatizables y que requieren analistas cualificados para su realización e interpetación (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE; MultiLocus Sequence Typing, MLST).

Sumario y perspectivas

Los métodos rápidos y automatizados en microbiología de los alimentos representan un área de la microbiología aplicada en continua expansión. La rapidez en la obtención de resultados es esencial en la industria alimentaria para reducir los tiempos de espera en los procesos de producción y liberar más rápidamente los lotes producidos. Además, la rapidez es fundamental en un programa de APPCC exitoso, ya que permite la aplicación de acciones correctoras durante el procesado de los alimentos. El tiempo ahorrado mediante el empleo de estos métodos puede utilizarse para otras tareas tales como revisar el plan de APPCC, ampliar los planes de control de patógenos y de análisis químicos (micotoxinas, antibióticos, alérgenos, etc.), formar a los empleados en los riesgos microbiológicos, etc.

Aunque en la actualidad la mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a la detección de bacterias, es previsible que se desarrollen nuevos métodos para la identificación rápida de virus y parásitos implicados en la transmisión de enfermedades a través de los alimentos. Asimismo, se espera que en el futuro próximo se incremente el uso de los biosensores en la industria alimentaria y de los microchips para la detección simultánea de varios patógenos, así como de envases inteligentes que alerten a los consumidores sobre la presencia de microorganismos alterantes o patógenos en los alimentos. Asistir a próximas ediciones del curso sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria será sin duda una excelente manera de estar al día de los avances que se produzcan en este dinámico campo.

Bibliografía

1. Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 1: 3-22.
2. Anónimo (2004). Fung´s forecast on rapid and automated methods: where are we now? Food Safety Magazine, agosto-septiembre: 24-31, 60.
3. Yuste, J., D.Y.C. Fung y M. Capellas (2007). Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria. Alimentaria, mayo 07, 78-80.
4. Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San Diego Business Journal.
5. Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. Crozier-Dodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free “Pop-up” adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 8(3): 209-217.
6. Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). Double-tube anaerobic bacteria cultivation system. Food Science, 7: 209-213.

Nota: La información contenida en este artículo se basa en las referencias citadas en la Bibliografía y en el manual del “VI Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria” (Bellaterra, 20-23 noviembre de 2007). Los nombres de productos e instrumentos comerciales y empresas se citan únicamente a título informativo y no implican en ningún caso la recomendación expresa de un producto determinado frente a otros de características similares.

Carmen Herranz Sorribes
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid

Hace poco más de un mes tuve la oportunidad de asistir al Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria que, bajo la dirección de los doctores Marta Capellas y Josep Yuste, se celebra anualmente en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona. Se trata de un curso muy interesante que permite adquirir una amplia visión de los métodos de detección e identificación rápida de los microorganismos presentes en los alimentos, así como conocer los últimos avances aplicables al análisis microbiológico en la industria alimentaria.

El curso consta de: (i) conferencias impartidas por destacados científicos españoles y extranjeros; (ii) presentaciones a cargo de expertos de importantes empresas de microbiología, incluyendo “rotaciones” en las que grupos reducidos de participantes en el curso asisten a la demostración del funcionamiento de equipos y productos; y (iii) dos sesiones prácticas de laboratorio, un taller y una visita a una empresa de Biología Molecular.

Entre los magníficos conferenciantes que intervinieron en el curso, destaca la figura del Dr. Daniel Y. C. Fung, profesor de la Kansas State University en Manhattan (Kansas) y director del mundialmente conocido Workshop on Rapid Methods and Automation in Microbiology que se celebra anualmente en la mencionada universidad desde 1980. El Dr. Fung, autoridad internacional en el campo de los Métodos Rápidos en Microbiología y autor de más de 700 artículos científicos en la materia, impartió seis interesantes conferencias basadas en su artículo Rapid Methods and Automation in Microbiology (1), cuyos aspectos más destacados presento a continuación.

El desarrollo de métodos rápidos y automatizados para la detección, aislamiento, identificación y enumeración de microorganismos (y/o sus metabolitos) relacionados con la alteración y seguridad de los alimentos es una subdivisión del área de la microbiología aplicada con una importancia cada vez mayor. En este sentido, según investigaciones de mercado realizadas en 2003 por Strategic Consulting Inc.´s, del total de ensayos microbiológicos realizados por la industria en el mundo (1.136,5 millones), el 58% (660, 5 millones) correspondieron a la industria de la alimentación (49%) y bebidas (9%). Aproximadamente, el 20% de los análisis se dirigieron a la detección de los microorganismos patógenos Salmonella y Escherichia coli O157:H7 y el 80% restante fueron análisis rutinarios (recuento total, de coliformes, de mohos y de levaduras). A nivel mundial, el porcentaje de ensayos realizado en Europa, América del Norte y el resto del mundo fue de un 33% en cada uno de los casos. No obstante, se estima que en un futuro próximo el porcentaje de ensayos realizados en el resto del mundo podría incrementarse hasta el 50% debido a la concienciación que están experimentando países con economías en desarrollo sobre la gran importancia de la seguridad alimentaria (1, 2, 3). Así por ejemplo, las autoridades sanitarias de China, país que se ha visto envuelto en varias ocasiones en escándalos debidos a la exportación de alimentos con condiciones higiénico-sanitarias no adecuadas, están tomando las medidas necesarias para asegurar el suministro de alimentos seguros a los más de 10.000 atletas y 3 millones de espectadores que se calcula asistirán a los Juegos Olímpicos que se celebrarán en agosto de este año en Beijing (4).

Los métodos microbiológicos “convencionales”, empleados actualmente en numerosos laboratorios de todo el mundo y establecidos en muchos casos como métodos estándares de análisis microbiológico de los alimentos, se caracterizan por ser laboriosos, emplear grandes volúmenes de medios de cultivo y requerir un tiempo considerable para la obtención y el análisis de los resultados. Por el contrario, los métodos rápidos requieren un tiempo reducido para la obtención de los resultados y/o permiten procesar un número elevado de muestras por unidad de tiempo, y son en general fáciles de usar, precisos (sensibilidad y especificidad adecuadas y límites de detección bajos) y económicamente rentables (aunque, en algunos casos, pueden requerir una inversión económica inicial considerable). Conviene destacar que, en la mayoría de los casos, el empleo de métodos rápidos no excluye la etapa de enriquecimiento del microorganismo diana ni la necesidad de obtener cultivos puros, así como que los resultados positivos obtenidos con métodos alternativos (distintos del método de referencia) no validados deben ser confirmados. Asimismo, es de suma importancia, al igual que en el caso de los métodos tradicionales, una adecuada toma y preparación de las muestras a analizar. En lo que se refiere a este último aspecto, destacan los siguientes avances: (i) para muestras sólidas, instrumentos gravimétricos que realizan automáticamente las diluciones programadas (Dilumat, AES Chemunex; Dilumacher, PBI; Labpro Gravimetric Diluter, Spiral Biotech) y homogeneizadores que funcionan mediante ondas de choque y una intensa agitación para transferir los microorganismos del alimento al diluyente, produciendo una mínima destrucción de la muestra (Pulsifier, Microgen); (ii) para muestras líquidas, sistemas rápidos para realizar diluciones seriadas (sistema Dilucup, LabRobots Products AB); (iii) para muestras de superficie, esponjas prehidratadas con un medio de transporte o enriquecimiento diseñadas para obtener muestras de lugares de difícil acceso (SpongeSicle y Extend-a-Sicle, Biotrace International) y el método “manos libres” para la obtención de muestras de la superficie de canales mediante el empleo de cinta adhesiva (5); y (iv) para muestras de aire, instrumentos portátiles que aspiran un volumen determinado de aire y recogen los microorganismos en la superficie del agar de placas de contacto para la estimación de la calidad microbiológica aire (SAS sampler, Bioscience International; MicroBio Air Sampler, Parrett).

Los métodos rápidos utilizados en microbiología de los alimentos pueden dividirse en cinco grandes grupos, incluyendo los empleados para el recuento de células viables, para la medición de la biomasa, los sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico, los inmunológicos y los genéticos. En la primera parte de este blog se tratan las innovaciones introducidas recientemente en los dos primeros grupos, mientras que en una segunda parte se tratarán las referidas a los tres últimos grupos.

Recuento de células viables

El recuento de células viables, tanto de los alimentos como de las superficies en contacto con los mismos y del aire de las industrias alimentarias, es uno de los parámetros más importantes a la hora de determinar la calidad y seguridad de los alimentos. Tradicionalmente, el recuento de células viables se ha realizado mediante el método estándar de recuento en placa, que,

aunque sencillo, es laborioso, requiere un volumen considerable de tubos de ensayo y medio de dilución, y espacio para el almacenamiento y la incubación de las placas de cultivo. En lo que se refiere a la preparación de placas de cultivo, destacan las siguientes mejoras: autómatas para la preparación y distribución de medios de cultivo (Masterclave, AES Chemunex); sistemas que incluyen pectina como agente gelificante en lugar de agar, evitando así la necesidad de calentar el medio para fundirlo (Redigel, 3M); y medios liofilizados que utilizan como soporte una película plástica de tamaño y grosor similar al de una tarjeta de crédito que contiene geles solubles en agua fría que se rehidratan al depositar la muestra en su superficie y que requieren un espacio mínimo para su almacenamiento e incubación (Petrifilm, 3M), existiendo asimismo instrumentos para la lectura rápida y automática de los resultados (Lector de placas 3M Petrifilm, 3M). En este apartado cabe asimismo destacar el desarrollo de numerosos medios de cultivo cromogénicos que acortan el tiempo necesario para la obtención de resultados (RAPID´ Chromogenic Methods, Bio-Rad; BBL CHROMagar, BD; medios cromogénicos bioMérieux; medios cromogénicos AES Chemunex). En cuanto a los métodos de siembra, existen sembradores automáticos en espiral que reducen o eliminan la necesidad de realizar diluciones seriadas de la muestra (Autoplate 4000, Spiral Biotech; WASP, Don Whitley Scientific Limited) y que facilitan el recuento mediante el empleo de contadores automáticos de colonias (Q Count, Spiral Biotech; EasyCount2, AES Chemunex). Con respecto a la enumeración de microorganismos, existen sistemas basados en la simplificación de la técnica del número más probable (NMP), que poseen un rango de enumeración amplio en ausencia de diluciones, tales como el sistema de filtración Isogrid/Neo-Grid (Neogen), que emplea una membrana con 1.600 celdillas o “compartimentos de crecimiento” delimitados por una rejilla hidrofóbica, y la placa SimPlate (Biocontrol), que permite recuentos de hasta 738 ufc (frente a las 300 ufc de una placa de cultivo convencional). Recientemente se ha miniaturizado y automatizado el método NMP mediante el empleo de tarjetas de material plástico que contienen 3 grupos de 16 pocillos, con 1 logaritmo de diferencia en volumen para cada grupo de pocillos, y medios de cultivo con indicadores fluorescentes (Tempo, bioMérieux). Este sistema disminuye considerablemente la necesidad de reactivos, espacio y tiempo con respecto al método NMP convencional. Aunque la mayoría de los métodos de recuento mencionados están diseñados para la enumeración de microorganismos aerobios, en los años 80, el Dr. Fung desarrolló un método ingenioso y sencillo para el recuento de microorganismos anaerobios, conocido como “doble tubo de Fung”, que permite lograr instantáneamente condiciones de anaerobiosis en el medio de cultivo y que no requiere sistemas generadores de hidrógeno ni jarras de anaerobiosis (6).

Los métodos citados en esta sección facilitan de diversas maneras la realización del recuento microbiano y/o disminuyen el tiempo necesario para la obtención de resultados. Sin embargo, necesitan un tiempo de incubación variable para que los microorganismos crezcan y puedan ser detectados y enumerados. Por el contrario, existen métodos para la realización de recuentos microbianos prácticamente en tiempo real basados en el empleo de colorantes fluorescentes que permiten distinguir células vivas de muertas mediante un microscopio de epifluorescencia (DEFT, del inglés Direct Epifluorescent Filter Technique), escáner (ScanRDI, AES Chemunex), o citómetro de flujo digital (BactiFlow ALS, AES Chemunex).

Medida de la biomasa microbiana

Puesto que el método “convencional” de recuento de microorganismos en placa es muy laborioso, se han desarrollado métodos para estimar de manera indirecta el número de microorganismos presentes en los alimentos. El desarrollo de dichos métodos está íntimamente ligado al de la instrumentación necesaria para detectar las señales relacionadas con el crecimiento microbiano. El principio en el que se basan estos sistemas es que dichas señales (niveles de ATP, enzimas específicas, pH, impedancia, conductancia y capacitancia eléctricas, etc.) se modifican paralelamente con el crecimiento microbiano. Conviene destacar que para que las mediciones sean significativas es necesario establecer la correlación entre estos parámetros y el recuento de células viables. .

Todas las células vivas contienen ATP, que se degrada muy rápidamente mediante autolisis al morir las células. En presencia de la enzima luciferasa y el sustrato luciferina (procedentes de la luciérnaga), oxígeno y magnesio, el ATP facilita el paso de la luciferina a oxiluciferina, generándose luz (bioluminiscencia) que puede ser detectada mediante un luminómetro. La cantidad de luz emitida en esta reacción es directamente proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra, es decir, al número de células vivas, y está correlacionada con la biomasa celular (la cantidad de ATP de 1 unidad formadora de colonia –ufc- oscila entre 0,22 y 1,03 fg). Este método (por ejemplo, el sistema Promicol) puede emplearse para la detección específica de ATP microbiano en productos líquidos tales como leche UHT, zumos, postres lácteos, etc., en los que es necesario determinar la presencia/ausencia de microorganismos. No obstante, la principal aplicación de este principio en la industria alimentaria se encuentra en la monitorización de la higiene de superficies. En este caso, la presencia de altos niveles de ATP de cualquier origen (microbiano o no) es indicativa de una limpieza deficiente. En la actualidad, existen numerosos sistemas que utilizan dispositivos del tipo escobillón o hisopo para la toma de muestra y luminómetros portátiles, robustos, sensibles y fáciles de utilizar que ofrecen lecturas rápidas (en menos de 1 min) del nivel de ATP (Ultrasnap y systemSURE Plus, Hygiena; Accupoint, Neogen; Lightning MVP, Biocontrol; Clean-Trace y Uni-Lite, 3M) lo que permite aplicar las acciones correctoras establecidas en el plan de Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico (APPCC) antes de que se contamine el producto. Asimismo, existen sistemas para la detección rápida de restos de proteínas o azúcares en las superficies que actúan como fuente de nutrientes para los microorganismos. Estos sistemas se basan en la reacción de dichos nutrientes con los reactivos presentes en hisopos especiales, lo que origina un cambio de color (reacción semicuantitativa) que puede detectarse visualmente (PRO-TECT, Biotrace International; PRO-Clean y SpotCheck plus, Hygiena; Clean Test, LiofilChem). De manera similar, puede detectarse la presencia de Listeria spp. en muestras ambientales de la industria alimentaria mediante el uso de escobillones a los que se les añaden antibióticos, sustancias enriquecedoras del crecimiento y compuestos indicadores que cambian de color en aproximadamente 30 h en caso de un resultado positivo (InSite, Hygiena; Listeria superficies PDX-LIB/Enviroswab, Paradigm Diagnostics/Tecra). Además, existen otros sistemas para la detección del crecimiento microbiano que se basan en el empleo de instrumentos más o menos sofisticados para la monitorización continua de los cambios de color del medio de cultivo relacionados con la actividad metabólica microbiana y que permiten obtener resultados en pocas horas (BacT/Alert 3D, bioMérieux; Soleris, Neogen).

Otro grupo de técnicas para la medida de la biomasa son las basadas en la detección de cambios en la conductividad eléctrica y la resistencia del medio de cultivo producidas como consecuencia del metabolismo de nutrientes de gran tamaño a moléculas de menor tamaño y químicamente más activas durante el crecimiento microbiano (Bactometer, bioMérieux; RABIT, Don Whitley Scientific Limited). Puesto que se conoce que para que estos cambios tengan lugar debe alcanzarse una población crítica de aproximadamente 10⁶ ufc/g, es posible estimar la población inicial de la muestra a partir del tiempo necesario para la detección de dichos cambios.

Bibliografía

1. Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 1: 3-22.
2. Anónimo (2004). Fung´s forecast on rapid and automated methods: where are we now? Food Safety Magazine, agosto-septiembre: 24-31, 60.
3. Yuste, J., D.Y.C. Fung y M. Capellas (2007). Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria. Alimentaria, mayo 07, 78-80.
4. Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San Diego Business Journal.
5. Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. Crozier-Dodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free “Pop-up” adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 8(3): 209-217.
6. Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). Double-tube anaerobic bacteria cultivation system. Food Science, 7: 209-213.

Nota: La información contenida en este artículo se basa en las referencias citadas en la Bibliografía y en el manual del “VI Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria” (Bellaterra, 20-23 noviembre de 2007). Los nombres de productos e instrumentos comerciales y empresas se citan únicamente a título informativo y no implican en ningún caso la recomendación expresa de un producto determinado frente a otros de características similares.

Carmen Herranz Sorribes
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid

La cocción al vacío es un método de trabajo utilizado desde hace relativamente poco tiempo en algunos sistemas de catering, que consiste en colocar el alimento crudo o precocinado en un envase estanco y termorresistente, extraer el aire de su interior, sellarlo herméticamente y someterlo a la acción del calor a temperatura constante y por el tiempo necesario.