Hace poco más de un mes tuve la oportunidad de asistir al Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria que, bajo la dirección de los doctores Marta Capellas y Josep Yuste, se celebra anualmente en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona. Se trata de un curso muy interesante que permite adquirir una amplia visión de los métodos de detección e identificación rápida de los microorganismos presentes en los alimentos, así como conocer los últimos avances aplicables al análisis microbiológico en la industria alimentaria.
El curso consta de: (i) conferencias impartidas por destacados científicos españoles y extranjeros; (ii) presentaciones a cargo de expertos de importantes empresas de microbiología, incluyendo “rotaciones” en las que grupos reducidos de participantes en el curso asisten a la demostración del funcionamiento de equipos y productos; y (iii) dos sesiones prácticas de laboratorio, un taller y una visita a una empresa de Biología Molecular.
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El Dr. Fung durante una de las ponencias del curso |
Entre los magníficos conferenciantes que intervinieron en el curso, destaca la figura del Dr. Daniel Y. C. Fung, profesor de la Kansas State University en Manhattan (Kansas) y director del mundialmente conocido Workshop on Rapid Methods and Automation in Microbiology que se celebra anualmente en la mencionada universidad desde 1980. El Dr. Fung, autoridad internacional en el campo de los Métodos Rápidos en Microbiología y autor de más de 700 artículos científicos en la materia, impartió seis interesantes conferencias basadas en su artículo Rapid Methods and Automation in Microbiology (1), cuyos aspectos más destacados presento a continuación.
El desarrollo de métodos rápidos y automatizados para la detección, aislamiento, identificación y enumeración de microorganismos (y/o sus metabolitos) relacionados con la alteración y seguridad de los alimentos es una subdivisión del área de la microbiología aplicada con una importancia cada vez mayor. En este sentido, según investigaciones de mercado realizadas en 2003 por Strategic Consulting Inc.´s, del total de ensayos microbiológicos realizados por la industria en el mundo (1.136,5 millones), el 58% (660, 5 millones) correspondieron a la industria de la alimentación (49%) y bebidas (9%). Aproximadamente, el 20% de los análisis se dirigieron a la detección de los microorganismos patógenos Salmonella y Escherichia coli O157:H7 y el 80% restante fueron análisis rutinarios (recuento total, de coliformes, de mohos y de levaduras). A nivel mundial, el porcentaje de ensayos realizado en Europa, América del Norte y el resto del mundo fue de un 33% en cada uno de los casos. No obstante, se estima que en un futuro próximo el porcentaje de ensayos realizados en el resto del mundo podría incrementarse hasta el 50% debido a la concienciación que están experimentando países con economías en desarrollo sobre la gran importancia de la seguridad alimentaria (1, 2, 3). Así por ejemplo, las autoridades sanitarias de China, país que se ha visto envuelto en varias ocasiones en escándalos debidos a la exportación de alimentos con condiciones higiénico-sanitarias no adecuadas, están tomando las medidas necesarias para asegurar el suministro de alimentos seguros a los más de 10.000 atletas y 3 millones de espectadores que se calcula asistirán a los Juegos Olímpicos que se celebrarán en agosto de este año en Beijing (4).
Los métodos microbiológicos “convencionales”, empleados actualmente en numerosos laboratorios de todo el mundo y establecidos en muchos casos como métodos estándares de análisis microbiológico de los alimentos, se caracterizan por ser laboriosos, emplear grandes volúmenes de medios de cultivo y requerir un tiempo considerable para la obtención y el análisis de los resultados. Por el contrario, los métodos rápidos requieren un tiempo reducido para la obtención de los resultados y/o permiten procesar un número elevado de muestras por unidad de tiempo, y son en general fáciles de usar, precisos (sensibilidad y especificidad adecuadas y límites de detección bajos) y económicamente rentables (aunque, en algunos casos, pueden requerir una inversión económica inicial considerable). Conviene destacar que, en la mayoría de los casos, el empleo de métodos rápidos no excluye la etapa de enriquecimiento del microorganismo diana ni la necesidad de obtener cultivos puros, así como que los resultados positivos obtenidos con métodos alternativos (distintos del método de referencia) no validados deben ser confirmados. Asimismo, es de suma importancia, al igual que en el caso de los métodos tradicionales, una adecuada toma y preparación de las muestras a analizar. En lo que se refiere a este último aspecto, destacan los siguientes avances: (i) para muestras sólidas, instrumentos gravimétricos que realizan automáticamente las diluciones programadas (Dilumat, AES Chemunex; Dilumacher, PBI; Labpro Gravimetric Diluter, Spiral Biotech) y homogeneizadores que funcionan mediante ondas de choque y una intensa agitación para transferir los microorganismos del alimento al diluyente, produciendo una mínima destrucción de la muestra (Pulsifier, Microgen); (ii) para muestras líquidas, sistemas rápidos para realizar diluciones seriadas (sistema Dilucup, LabRobots Products AB); (iii) para muestras de superficie, esponjas prehidratadas con un medio de transporte o enriquecimiento diseñadas para obtener muestras de lugares de difícil acceso (SpongeSicle y Extend-a-Sicle, Biotrace International) y el método “manos libres” para la obtención de muestras de la superficie de canales mediante el empleo de cinta adhesiva (5); y (iv) para muestras de aire, instrumentos portátiles que aspiran un volumen determinado de aire y recogen los microorganismos en la superficie del agar de placas de contacto para la estimación de la calidad microbiológica aire (SAS sampler, Bioscience International; MicroBio Air Sampler, Parrett).
Los métodos rápidos utilizados en microbiología de los alimentos pueden dividirse en cinco grandes grupos, incluyendo los empleados para el recuento de células viables, para la medición de la biomasa, los sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico, los inmunológicos y los genéticos. En la primera parte de este blog se tratan las innovaciones introducidas recientemente en los dos primeros grupos, mientras que en una segunda parte se tratarán las referidas a los tres últimos grupos.
Recuento de células viables
El recuento de células viables, tanto de los alimentos como de las superficies en contacto con los mismos y del aire de las industrias alimentarias, es uno de los parámetros más importantes a la hora de determinar la calidad y seguridad de los alimentos. Tradicionalmente, el recuento de células viables se ha realizado mediante el método estándar de recuento en placa, que,
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El “doble tubo de Fung”, un sistema sencillo y económico para el crecimiento de microorganismos anaerobios |
aunque sencillo, es laborioso, requiere un volumen considerable de tubos de ensayo y medio de dilución, y espacio para el almacenamiento y la incubación de las placas de cultivo. En lo que se refiere a la preparación de placas de cultivo, destacan las siguientes mejoras: autómatas para la preparación y distribución de medios de cultivo (Masterclave, AES Chemunex); sistemas que incluyen pectina como agente gelificante en lugar de agar, evitando así la necesidad de calentar el medio para fundirlo (Redigel, 3M); y medios liofilizados que utilizan como soporte una película plástica de tamaño y grosor similar al de una tarjeta de crédito que contiene geles solubles en agua fría que se rehidratan al depositar la muestra en su superficie y que requieren un espacio mínimo para su almacenamiento e incubación (Petrifilm, 3M), existiendo asimismo instrumentos para la lectura rápida y automática de los resultados (Lector de placas 3M Petrifilm, 3M). En este apartado cabe asimismo destacar el desarrollo de numerosos medios de cultivo cromogénicos que acortan el tiempo necesario para la obtención de resultados (RAPID´ Chromogenic Methods, Bio-Rad; BBL CHROMagar, BD; medios cromogénicos bioMérieux; medios cromogénicos AES Chemunex). En cuanto a los métodos de siembra, existen sembradores automáticos en espiral que reducen o eliminan la necesidad de realizar diluciones seriadas de la muestra (Autoplate 4000, Spiral Biotech; WASP, Don Whitley Scientific Limited) y que facilitan el recuento mediante el empleo de contadores automáticos de colonias (Q Count, Spiral Biotech; EasyCount2, AES Chemunex). Con respecto a la enumeración de microorganismos, existen sistemas basados en la simplificación de la técnica del número más probable (NMP), que poseen un rango de enumeración amplio en ausencia de diluciones, tales como el sistema de filtración Isogrid/Neo-Grid (Neogen), que emplea una membrana con 1.600 celdillas o “compartimentos de crecimiento” delimitados por una rejilla hidrofóbica, y la placa SimPlate (Biocontrol), que permite recuentos de hasta 738 ufc (frente a las 300 ufc de una placa de cultivo convencional). Recientemente se ha miniaturizado y automatizado el método NMP mediante el empleo de tarjetas de material plástico que contienen 3 grupos de 16 pocillos, con 1 logaritmo de diferencia en volumen para cada grupo de pocillos, y medios de cultivo con indicadores fluorescentes (Tempo, bioMérieux). Este sistema disminuye considerablemente la necesidad de reactivos, espacio y tiempo con respecto al método NMP convencional. Aunque la mayoría de los métodos de recuento mencionados están diseñados para la enumeración de microorganismos aerobios, en los años 80, el Dr. Fung desarrolló un método ingenioso y sencillo para el recuento de microorganismos anaerobios, conocido como “doble tubo de Fung”, que permite lograr instantáneamente condiciones de anaerobiosis en el medio de cultivo y que no requiere sistemas generadores de hidrógeno ni jarras de anaerobiosis (6).
Los métodos citados en esta sección facilitan de diversas maneras la realización del recuento microbiano y/o disminuyen el tiempo necesario para la obtención de resultados. Sin embargo, necesitan un tiempo de incubación variable para que los microorganismos crezcan y puedan ser detectados y enumerados. Por el contrario, existen métodos para la realización de recuentos microbianos prácticamente en tiempo real basados en el empleo de colorantes fluorescentes que permiten distinguir células vivas de muertas mediante un microscopio de epifluorescencia (DEFT, del inglés Direct Epifluorescent Filter Technique), escáner (ScanRDI, AES Chemunex), o citómetro de flujo digital (BactiFlow ALS, AES Chemunex).
Medida de la biomasa microbiana
Puesto que el método “convencional” de recuento de microorganismos en placa es muy laborioso, se han desarrollado métodos para estimar de manera indirecta el número de microorganismos presentes en los alimentos. El desarrollo de dichos métodos está íntimamente ligado al de la instrumentación necesaria para detectar las señales relacionadas con el crecimiento microbiano. El principio en el que se basan estos sistemas es que dichas señales (niveles de ATP, enzimas específicas, pH, impedancia, conductancia y capacitancia eléctricas, etc.) se modifican paralelamente con el crecimiento microbiano. Conviene destacar que para que las mediciones sean significativas es necesario establecer la correlación entre estos parámetros y el recuento de células viables. .
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La bioluminiscencia del ATP puede emplearse para evaluar la limpieza de las superficies en contacto con los alimentos |
Todas las células vivas contienen ATP, que se degrada muy rápidamente mediante autolisis al morir las células. En presencia de la enzima luciferasa y el sustrato luciferina (procedentes de la luciérnaga), oxígeno y magnesio, el ATP facilita el paso de la luciferina a oxiluciferina, generándose luz (bioluminiscencia) que puede ser detectada mediante un luminómetro. La cantidad de luz emitida en esta reacción es directamente proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra, es decir, al número de células vivas, y está correlacionada con la biomasa celular (la cantidad de ATP de 1 unidad formadora de colonia –ufc- oscila entre 0,22 y 1,03 fg). Este método (por ejemplo, el sistema Promicol) puede emplearse para la detección específica de ATP microbiano en productos líquidos tales como leche UHT, zumos, postres lácteos, etc., en los que es necesario determinar la presencia/ausencia de microorganismos. No obstante, la principal aplicación de este principio en la industria alimentaria se encuentra en la monitorización de la higiene de superficies. En este caso, la presencia de altos niveles de ATP de cualquier origen (microbiano o no) es indicativa de una limpieza deficiente. En la actualidad, existen numerosos sistemas que utilizan dispositivos del tipo escobillón o hisopo para la toma de muestra y luminómetros portátiles, robustos, sensibles y fáciles de utilizar que ofrecen lecturas rápidas (en menos de 1 min) del nivel de ATP (Ultrasnap y systemSURE Plus, Hygiena; Accupoint, Neogen; Lightning MVP, Biocontrol; Clean-Trace y Uni-Lite, 3M) lo que permite aplicar las acciones correctoras establecidas en el plan de Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico (APPCC) antes de que se contamine el producto. Asimismo, existen sistemas para la detección rápida de restos de proteínas o azúcares en las superficies que actúan como fuente de nutrientes para los microorganismos. Estos sistemas se basan en la reacción de dichos nutrientes con los reactivos presentes en hisopos especiales, lo que origina un cambio de color (reacción semicuantitativa) que puede detectarse visualmente (PRO-TECT, Biotrace International; PRO-Clean y SpotCheck plus, Hygiena; Clean Test, LiofilChem). De manera similar, puede detectarse la presencia de Listeria spp. en muestras ambientales de la industria alimentaria mediante el uso de escobillones a los que se les añaden antibióticos, sustancias enriquecedoras del crecimiento y compuestos indicadores que cambian de color en aproximadamente 30 h en caso de un resultado positivo (InSite, Hygiena; Listeria superficies PDX-LIB/Enviroswab, Paradigm Diagnostics/Tecra). Además, existen otros sistemas para la detección del crecimiento microbiano que se basan en el empleo de instrumentos más o menos sofisticados para la monitorización continua de los cambios de color del medio de cultivo relacionados con la actividad metabólica microbiana y que permiten obtener resultados en pocas horas (BacT/Alert 3D, bioMérieux; Soleris, Neogen).
Otro grupo de técnicas para la medida de la biomasa son las basadas en la detección de cambios en la conductividad eléctrica y la resistencia del medio de cultivo producidas como consecuencia del metabolismo de nutrientes de gran tamaño a moléculas de menor tamaño y químicamente más activas durante el crecimiento microbiano (Bactometer, bioMérieux; RABIT, Don Whitley Scientific Limited). Puesto que se conoce que para que estos cambios tengan lugar debe alcanzarse una población crítica de aproximadamente 106 ufc/g, es posible estimar la población inicial de la muestra a partir del tiempo necesario para la detección de dichos cambios.
Bibliografía
- Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 1: 3-22.
- Anónimo (2004). Fung´s forecast on rapid and automated methods: where are we now? Food Safety Magazine, agosto-septiembre: 24-31, 60.
- Yuste, J., D.Y.C. Fung y M. Capellas (2007). Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria. Alimentaria, mayo 07, 78-80.
- Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San Diego Business Journal.
- Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. Crozier-Dodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free “Pop-up” adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 8(3): 209-217.
- Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). Double-tube anaerobic bacteria cultivation system. Food Science, 7: 209-213.
Nota: La información contenida en este artículo se basa en las referencias citadas en la Bibliografía y en el manual del “VI Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología Alimentaria” (Bellaterra, 20-23 noviembre de 2007). Los nombres de productos e instrumentos comerciales y empresas se citan únicamente a título informativo y no implican en ningún caso la recomendación expresa de un producto determinado frente a otros de características similares.
Carmen Herranz Sorribes
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid